اسپکتروفتومتر

کالیبراسیون اسپکتروفتومتر (طیف سنج نوری)

 اسپکتروفتومتر (Spectrophotometer) یا طیف سنج یک دستگاه آزمایشگاهی اولیه است که جهت خواندن نتایج آزمایش‌هایی که واکنش آن‌ها از نوع End point هستند به کار می‌رود. این دستگاه میزان جذب یا عبور طول موج‌های مشخصی از انرژی تابشی (نور) از یک محلول را اندازه گیری می‌کند بیشترین کاربرد آن در آزمایشگاه، در بخش بیوشیمی است.اساس کار اسپکتروفتومتر همانند بسیاری از دستگاه‌های آزمایشگاهی، بر اندازه گیری میزان نور جذب شده توسط یک محلول رنگی است که طبق قانون بیر-لامبرت میزان جذب نور (OD) متناسب با غلظت ماده حل شده در محلول است.

کووت

کــووت‌هــا مـحـفـظــه‌هــای شـفــافــی هـستنـد کـه مـحـلـول مـورد آزمـایـش در آن ریـخـتـه شـده و در جایگاه خاص خود که در مسیر نور تکرنگ تعبیه شده است قرار می‌گیرد. کووت‌ها با توجه به نوع مصرف، جنس، شکل و حجم متفاوتی دارند. برای مـحـلــول‌هــای اسـیــدی و قـلـیــایـی از کـووت‌هـای مـخـصوص شیشه‌ای و برای طول موج‌های زیر ۳۲۰ نـانـومـتـر از لـولـه کوارتز یا پلاستیک استفاده می‌شود.

کالیبراسیون
کالیبراسیون اسپکتروفتومتر، فرایندی است که در آن مراحلی جهت تضمین صحت کار دستگاه به‌کار گرفته می‌شود. این روش تضمین می‌کند که اندازه گیری‌های به دست آمده توسط وسیله مورد نـظــر دقـیــق هـسـتـنــد. روش کــالـیـبــراسـیــون بــرای مدل‌های مختلف متفاوت است با این حال اکثر تـولـیـدکـنـنـدگـان کـتـابـچـه راهـنـمـایـی را کـه شـامل جزئیات کالیبراسیون و نحوه کار با دستگاه است، برای استفاده کاربران فراهم می کنند.
اسپکتروفتومتر قادر است تا به عنوان فرستنده و گـیــرنــده نــور عـمـل کنـد. ایـن وسیلـه بـرای آنـالیـز نمونه‌هایی از ماده تست، توسط عبور نور از درون نمونه و خواندن شدت طول موج‌ها مورد استفاده قــرار مــی‌گـیــرد. نـمــونــه‌هــای مـخـتـلـف نـور را بـه روش‌هـای مختلـف فشـرده مـی‌کننـد و بـه محقق اجازه می‌دهند تا توسط بررسی رفتار نور هنگام عبور از نمونه مورد نظر، با ساختار آن بیشتر آشنا شوند. در کالیبراسیون این وسیله، از یک محلول مرجع جهت تنظیم صفر دستگاه استفاده می‌شود.  در اسپکتروفتومتر تک پرتویی، یک پرتو نور تولید و دستگاه باید بعد از هر بار استفاده، کالیبره شود. در نــوع دو پــرتـویـی، پـرتـوهـا از طـریـق نمـونـه تسـت فرستاده می‌شوند و نمونه مرجع در همان زمان، دو مجموعه از نتایج را که می‌تواند به عنوان مرجع و کـــالــیـبــراسـیــون اسـتـفــاده شــود، تــولـیــد مــی‌کـنــد. کـالـیبراسیون می‌تواند در آزمایشگاه توسط افراد باتجربه نیز صورت گیرد. البته اگر دستگاه دچار آسیب یا مشکل جدی شود، باید جهت تعمیر و تنظیمات اولیه به کارخانه سازنده یا نمایندگی‌های معتبر ارجاع داده شود.  
۱- دستگاه را روشن کنید و ۱۰ دقیقه منتظر بمانید تا دستگاه گرم و آماده به کار شود.
۲- نور محفظه را تغییر دهید تا به طول موج مورد نظر برسید.
۳- کووت را تا نیمه با محلول واکنش پر کنید. کووت نباید حاوی نمونه ناشناخته باشد.
۴- دو طرف کووت را با دستمال پاک کنید.
۵- آن را در مـحـفـظــه قــرار دهـیـد و درب آن را ببندید.
۶- منتظر بمانید تا اندازه گیری تمام شود.

ارزیـابـی صـحـت طـول مـوج به منظور ارزیابی ادعـای سـیـسـتـم درتـابـاندن طول موجی است که دستگاه برای آن تنظیم شده است.  
‌راحت‌ترین و قابل دسترس‌ترین  روش برای اسپکتروفتومترهایی که با نور مرئی کار می‌کنند، اســتــفـــاده از مـحـلــول سـیــان‌ مــت ‌هـمــوگـلــوبـیــن (۲۰ میکرولیتر خون و ۵ میلی لیتر درابکین ) بوده که دارای حــــداکــثــــر جــــذب نـــوری در طـــول مـــوج ۵۴۰ نانومتر است. ابتدا با محلول درابکین به عنوان بلانک دستگاه را صفر کرده و سپس جذب نوری نمونه در طول موج ۵۳۰ ، ۵۳۵،  ۵۴۰ ، ۵۴۵  و  ۵۵۰ نـانـومـتـر قـرائـت مـی‌شـود. بر‌‌اساس طول موج و مـیـزان جـذب ،یـک مـنـحـنـی رسـم می‌شود که در صورت وجود صحت طول موج ، حداکثر جذب نوری را در ۵۴۰ نانومتر نشان خواهد داد.

آزمون رانش فوتومتری
یکی از منابع اصلی خطا در اسپکتروفتومتری، کــه بــه عـلـت فـرسـودگـی شـدیـد مـنـبـع نـوری رخ می‌دهد، عدم پایداری مقدار جذب خوانده شده درطول زمان است. برای بررسی، ابتدا دستگاه را با درابـکـیــن صـفــر کــرده و پــس از ریـخـتـن محلـول سیان‌مت هموگلوبین در کووت و بستن درب آن با پارافیلم، جذب نوری این محلول هر ۵ تا ۱۵ دقیقه یک‌بار (به مدت یک ساعت) قرائت کنید. حداکثر تغییر مجاز در جذب‌های نوری قرائت شده طی این مدت ۰۰۵/۰-+‌  است. به عنوان مثال اگرجذب محلولی در ابتدا ۲۵۹/۱‌ باشد، در مدت یک ساعت می‌تواند در محدوده ۰۰۵/۰‌ -+‌  ۲۵۹/۱‌ تغییر کند.

نحوه کار با اسپکتروفتومتر D 20/20
۱- دستگاه را روشن کنید. اجازه دهید تا به مدت ۱۵ دقیقه گرم شود.  
۲- طول موج مورد نظر را با دکمه قرار گرفته در کنار محفظه نمونه تنظیم کنید.
۳- محفظه نمونه را بررسی کنید تا از خالی بودن آن مطمئن شوید. دکمه مربوط به تنظیم صفر را که در جـلـو و سـمـت چـپ اسـپـکـتـروفـتـومـتـر اسـت، بچرخانید تا مقدار صفر را نمایش دهد.
۴- برای اطمینان از پاکیزگی و کاهش اشتباه در نتایج اندازه گیری، از دستکش استفاده کنید.
۵- ۴/۳ کووت را با آب مقطر پر کنید و آن را در نگـه دارنـده قـرار دهید. کووت را به سمت پایین فشار دهید تا در جای خود تراز شود. دقت کنید که خارج کووت تمیز و خشک باشد.
۶- دکمه کنترل نور را که در جلو و سمت راست دستگـاه قـرار دارد، بچـرخانید تا مقدار عبوری یا جذب را بخواند.
۷- سپس کووت نمونه را در محفظه قرار دهید. مقدار نشان داده شده را ثبت کنید.

کالیبراسیون اسپکتروفتومتر مادون قرمز
اسپکتـروفتومتر مادون قرمز از پلی استایرن به عنوان یک استاندارد کالیبراسیون استفاده می کند. A-Scan ابــزار بــا یــک قـطـعــه از پـلــی استـایـرن در نگه‌دارنده نمونه، حضور قله‌های دیده شده روی طیف IR و شدت نسبی قله‌ها را بازبینی می‌کند.
۱- اسپکتروفتومتر را روشن کرده و جهت ثبات دستگاه، اجازه دهید تا ۱۰ دقیقه گرم شود. بدون وجود منبع پایدار، نمی توان بر طیف به دست آمده اعتماد کرد.
۲- اسـتـانـدارد کـالـیـبـراسیون را توسط قراردادن نمونه‌ای از فیلم پلی استایرن در نگه دارنده نمونه انجام دهید. بدون اجرای آزمون با استفاده از یک نـمـونه از طیفی شناخته شده که استاندارد نامیده می‌شود، نمی‌توانید در مورد درستی و صحت کار دستگاه به یقین برسید.
۳- طیف را برای نمونه پلی استایرن بازیابی کنید. طیف را با یکی از مراجع استاندارد طیف IR مقایسه کنید تا مطمئن شوید که همه قله‌های مورد انتظار روی طیف آزمون وجود دارد.
۴- طـیـف را بـررسـی کـنـیـد تـا مطمئن شوید که قدرت سیگنال درون ۹۵% از حداکثر قوی‌ترین قله است.
۵- میرایی را تنظیم کنید تا به سیگنال صحیح و مورد نظرتان دست یابید.

توجه
‌مـمـکن است فیلترهای نوری خاصی برای تـعـدادی از دسـتـگاه‌ها نیاز باشد که با طول موج ویژه‌ای کار می‌کنند.  
‌اگر طول موج تغییر کرده است یا بعد از هر نمونه‌گیری، باید صفر دستگاه تنظیم شود.

‌اطمینان حاصل کنید که کووت‌ها خالی از هرگونه ذرات، لکه یا اثر انگشت است. این مورد می‌تواند محاسبات دستگاه را تحت تاثیر قرار دهد.
‌اسـپـکـتــروفـتــومـتـرهـا گـران هستنـد. مـراقـب باشید تا به آن‌ها صدمه‌ای وارد نشود.

بررسی های روزانه
اتـصـالات الـکـتریکی را به طور کامل بازرسی کنید تا هیچ گونه ساییدگی نداشته باشند.
تحت هیچ شرایطی کارکنان مجاز به بازکردن دستگاه نیستند.
هرگونه مایعات خارجی و مواد شیمیایی ریخته شده را از روی دستگاه و قسمت‌های مجاور آن، پاک کنید.
نگه دارنده نمونه را مخصوصا بعد از به کاربردن محلول‌های نمکی یا خورنده به دقت تمیز کنید.
کــــووت‌هــــا را بـــلافـــاصــلـــه بــعـــد از اســتــفـــاده بـشــوییـد.سپـس آن‌هـا را بـرعکـس کنیـد تـا کـامـلا خـشــک شــونـد. اجـازه نـدهـیـد نـمـونـه در کـووت خشک شود.

منبع: ماهنامه مهندسی پزشکی