مراحل PCR به طور خلاصه

مراحل PCR به طور خلاصه

۱- denaturation حرارت دادن برای جداسازشدن دو رشته DNA در یک دقیقه

۲- anealing یا چسبیدن آغاز گر ( اتصال پرایمر به هدف ۹ دمای ۴۰ـ ۶۰ که در این مرحله مقدار دما بستگی به توالیهای بازی پرایمر های مکمل توالی رشته DNA دارد آغاز گر ها ، در دمایی که مانع اتصال غیر اختصاص آنها می شود . مساوی ۵۰% باشد این دما ۵۵ و اگر بیشتر باشد درجه حرارت اتصال برابر ۶۰ است . زیرا c و g دارای ۳ پیوند هستند .

۳- polymerization گسترش رشته DNA : در این مرحله DNA پلیمراز شروع به همانند سازی می کند . و طویل شدن رشته مکمل ازOH اغازگر شروع می شود . در این واکنش از DNA پلیمراز مخصوص که در برابر حرارت مقاوم است به نام tag DNA polimerase استفاده می گردد . این انزیم در دمای ۹۴ کاملا پایدار است ودمای اپیتم عمل آن ۷۲ c است .

۴- تکرار این مراحل تا چند سیکل که در نتیجه مقدار قابل توجهی DNA سنتز شود . تکثیر DNA پس از چسبیدن اغازگر به انتهای ۵ توالی های مشخص از DNA الگو صورت می گیرد تکرار مراحل باز شدن دو رشته dna با چسبیدن اغازگر و طریل شدن ان را یک سیکل پی سی ار می نامند .

۵- پس از یک سیکل pcr از یک مولکول DNA دو مولکول و پس از سیکل دوم چهار مولکول و پس از ۲۰ مولکول DNA وجوددارد این عمل را می توان با استفاده از دستگاه اتوماتیک ترمال سایکلر که قابل برنامه ریزی است به اسانی انجام می گردد .

۶- تعداد چرخه ها یا سیکلها بستگی به کیفیت واکنش و مقدار DNA الگو در واکنش دارد ولی عموما بین ۲۵ـ۳۵ و معمولا ۳۰ است با افزایش تعداد سیکلها باندهای ناخواسته افزایش می یابد .

مواد لازم PCR

۱- بافر PCR: شرایط یونی PH مناسب را برای واکنش PCR فراهم می کند

نکته : بافر به صورت x10 ساخته می گردد . این بافر شامل موادی با غلظت های زیر می باشد . دارای گلیسیرول برای سنگینی کار و دارای رنگ برای مشهود سازی DNAدارد .

۲- دزوکسی نوکلئوتید تری فسفات

که به صورت مخلوطی از چهار باز A-T-C-G در بازار وجوددارد تا کنار هم چیده شوند . و رشته مکمل را ایجاد کنند .

۳- اغازگرها primer : پرایمرها قطعات سنتز شده ای از بازهای آلی اند که بر اساس قطعه ای مورد نظر الگوهای هدف ساخته می شوند . که معمولا با طول ۱۵ـ۳۰ نوکلئوتیدهستند که به DNA الگو متصل می شوند و دارای انتهای ۳oh آزاد هستند .

طول پرایمرها بسیار مهم است هر چه طول پرایمر بلند باشد اختصاصی تر عمل می کند برای تعیین طول مناسب می توان از رابطه ( تعداد بازها در ژنوم هدف ۴٫۴٫۴…..>x2 ) استفاده کرد . که n برابر تعداد بازهای مناسب برای اغازگر می باشد .

این دو پرایمر دو عمل انجام می دهند . اول این که محل ژنی که باید تکثیر شود را مشخص می نمایند و دوم این که اندازه قطعات تکثیر شونده را تعیین می کنند .

باید توجه داشت دو پرایمر دارای نقطه ذوب نزدیک به هم باشند پرایمر مورد نظر توسط کامپیوتر انتخاب می گردد .

۴- tag DNA polymerase: یک انزیم مقاوم به دما است که همانند سازی DNA را انجام می دهد این انزیم از باکترtremmus aquaticus بدست آمده است جهت سنتز DNAهمیشه از ۳ـ ۵ می باشد و همه انزیمها برای شروع فعالیت سنتز DNA را انجام می دهد . که توسط قطعات کوتاه آغازگر ها تامین می گردد. در واقع این انزیم غلط گیری می کند . تا قبل از کشف آنزیم tag از انزیمw kleno استفاده می شد . آنزیم tag پلیمراز باعث شد به راحتی واکنش PCR به ورت اتوماتیک انجام شود . و با افزودن یکبار انزیم افزایش حساسیت و دقت PCR است .

۵) آب برای نهایی کردن O2H.Dکه باید کل ان حجم ۵۰ml یا ۲۵ml باشد .

۶ـ mgcl2 کلرید منیزیم نقش کوفاکتوری در فعالیت آنزیم tag دارد .

اثر متقابل رشته dna الگو و آغازگر را افزایش می دهد . غلظت کلریدمنیزیم اثر زیادی برروی اختصاصی شدن و نهایتا بازده واکنش PCRدارد .

غلظت زیاد ان اثر بازدارندگی برروی فعالیت آنرزیم تک دی ان آپلی مراز دارد و مقدار محصول نهایی را کاهش می دهد رابطه مستقیمی بین افزایش غلظت dntps و mgcl در محلول واکنش وجوددارد و مقدار مناسب ان باید به طور عملی در آزمایشگاه بدست آید .

۷ـ دی ان آ الگو tempate DNA :

بستر به هدف ازمایش از منابع موردنیاز با استفاده از یکی از روشهای مرسوم استخراج می شود . معمولا به ازای هر واکنش ۵% واحد یا ۱% میکرو لیتر استفاده می شود .

۸ـ لوله های واکنش : لوله های کوچک ۵% میلی لیتر

۹- سمپلریا میکرو پیست و سر سمپلرهای یکبار مصرف مخصوص انها کهرای برداشتن مقادیر بسیار کم استفاده می گردد .

۱۰- دستگاه چرخش حرارتی

۱۱- میکرو فیوژ

۱۲- روغن معدنی mineraloil : یک قطره روی مخلوط واکنش اضافه می شود تا از تبخیر نمونه در دستگاه چرخش حرارتی thermal cycler جلوگیری می شود . معمولا ۵۰ ـ ۶۰ میکرولیتر به حلول واکنش ۱۰۰ میکرولیتری اضافه می شود .

ضمنا باید توجه داشت که مواد قابل اتوکلاو استریل شوند . البته dntp پرایمرهاو آنزیم tag را نمی توان اتو کلاو کرد .

بازدارنده ها و افزاینده های فعالیت PCR:

۱- مواد موجود در نمونه های متفاوت موجودات زنده مانند وجود ترکیبات فنلی و غیره که باید با انتخاب صحیح روش استخراج از محلول DNA جداشود .

۲- شوینده های موجود در بافر استخراج : در مراحل استخراج DNA از شوینده های غیر یونی مانند tritonx و twen و… استفاده می شود . که برروی PCR اثر باز دارندگی ندارند ولی شوینده های یونی مثل sds (سدیم دودسیل سولفات ) فقط به مقدار کم در محلول قابل تحمل می باشد . بنابراین با استفاده از فنل و یا شستشو با الکل باید این مواد را از DNA جداکرد . مقدار ۱% از ان برای پی سی ار عامل بازدارنده محسوب می شود .

۳- آنزیم پروتئیناز k که در مراحل استخراج DNA همراه با مواد شوینده برای هضم پوتئین استفاده می شود . به عنوان بازدارنده فعالیت PCR می باشد . زیرا انزیم tag نسبت به انزیم حساس می باشد . و این انزیم cDk باید حذف یا غیر فعال شود . با تیمار گرمایی می توان سبب غیر فعال شدن این انزیم شد که در این صورت بایستی بعد از تلخیص DNAبافنل و کلروفوم ان را هم سانتریوفوژ نمود که در این صورت باقیمانده پروتئیناز k به داخل فاز فنلی وارد شده و DNA در فاز مایع باقی می ماند .

۴- باقیمانده فنلی : فنل نیز بایستی از محیط خارج شود زیرا بازدارندگی بر فعالیت انزیم tag DNA polymerase دارد . که به این منظور پس از استفاده از فنل و کلروفرم از ایزو پروپانول استفاده کرد .

افزاینده های فعالیت PCR:

ماده و غلظت

فورمامید  ۵%

دی متیل سولفوکسید کمتر از ۱۰%

تترامتیل امونیوم کلراید  ۱۰۰ – ۱۰ %

پلیاتیلن گلیکول ۶۰۰۰ ۵% ـ ۱۵

گلیسرول     ۱۰%- ۱۵

توین۲۰       ۵/۲ – ۱/۰ %

پروتکل PCRمعمولی

حجم نهایی واکنش PCR که انجام خواهید داد ۲۵ Ml باشد تمام اجزاء فوق بجز DNA الگو ابتدا دریک لوله mix به تعداد لوله های تهیه و سپس بین لوله ها تقسیم می شود . و پس یک لوله شاهد مثبت و یک لوله شاهد منفی نیز باید داشته باشد لوله شاهد مثبت حاوی DNA الگویی است که قبلا کارایی ان در واکنش pcr تایید شده است لوله شاهد منفی بدون الگو می باشد بعد از اضافه کردن تمام محلولهای یک قطره روغن معدنی برای جلوگیری از تبخیر به ان اضافه نموده و پس لوله ها را در دستگاه pcr قرار دهید .

درجه حرارت وزمان مناسب برای دستگاه :

سیکل اول :

۱- سه دقیقه ۹۲ـ۹۴ واسرشت کردن

۲- ۵۰ ثانیه ۵۰ –۶۰ اتصال آغازگرها

۳- ۱ دقیقهDNAسازی

سیکل بعدی

۱- ۴۵-ثانیه ۹۲ـ۹۴ واسرشت کردن

۲-۵۰ ثانیه ۵۰- ۶۰ اتصال اغازگرها

۳-۱دقیقه  DNAسازی

سیکل آخر

۱ـ۴۵ ثانیه ۹۲ـ ۹۴ واسرشت کردن

۲ـ۵۰ ثانیه ۵۰ –۶۰ اتصال اغازگرها

۳ـ۴-۱۰ دقیقه  DNA سازی