محفظه‌های بی هوازی

محفظه‌های بی هوازی

محفظه‌های بی هوازی و جعبه‌های دستکش امکان کشت و پرورش نمونه ها ، مشاهده رشد ، انجام تست‌های بعدی و گرم کردن نمونه‌ها تحت شرایط بی هوازی را برای پرسنل آزمایشگاه فراهم می‌کنند. باکتری‌های بی‌هوازی مختلف در مقابل تأثیرات  اکسیژن ، میزان آسیب پذیری‌های متفاوتی دارند ؛ در حالی که گونه‌های میکروآئروفیل و تا حدی بی هوازی ، تا حدی می توانند اکسیژن را تحمل کنند اما باکتری های بی هوازی اجباری ، ممکن است حتی بعد از این که اندکی در معرض اکسیژن قرار بگیرند ، غیرقابل کشت شوند. فرآیند رنگ آمیزی Gram که نقش مهمی در شناسایی اولیه بی هوازی ها دارد ، باکتری‌ها را به دو گروه تقسیم می‌کند: دسته Gram مثبت و دسته Gram منفی.

مــزیــت اصـلــی مـحـفـظــه‌هــای بــی هـوازی و جـعـبـه‌هـای دستکش نسبت به قالب‌های (jar) بی‌هوازی این است که تکنسین می‌تواند بدون وارد شـدن اکـسـیـژن هـوا بـه داخـل مـحـفـظـه ، با نـمونه‌ها کار کرده و آن‌ها را ارزیابی کند. یک جایگزین دیگر برای محفظه‌های بی هوازی و جعبه‌های دستکش ، سیستم roll-tube است که در آن ، ارگانیزم‌ها روی یک لایه از اگار رشد داده مـی‌شـونـد کـه دیواره‌های داخلی لوله تست را می پوشاند. سپس لوله‌ها در یک محیط غنی از دی اکسید کربن قرار داده می‌شوند. مزیت این روش این است که می توان هر لوله را بدون ایجاد مــزاحـمـت بـرای نـمـونـه‌هـای کـشـت داده شـده اطـراف آن ، بـررسـی کـرد ؛ مشکل این است که استفاده از لوله‌ها می‌تواند دست و پاگیر باشد و مورفولوژی داخل لوله‌ها ممکن است نسبت به صفحه‌های اگار تمایز کمتری داشته باشند.  
عفونت‌های باکتری‌های بی هوازی اغلب ، مرتبط با آبسه‌های داخلی (مانند داخل شکمی ، کبد ، ریه و مغز) هستند و بیماران عفونی اغلب به شــدت بـیـمــارنــد. بـنـابـرایـن ضـروری اسـت کـه سرعت عامل میکروبی ایجادکننده بیماری ، کشت شده و شناسایی شود. عفونت‌های بی‌هوازی ممکن است منشاء داخلی یا خارجی داشته باشند. عفونت‌های داخلی ناشی از ارگانیزم‌های بی هوازی هستند که بخشی از فلور طبیعی انسان هستند و تحت شرایط مناسب ، مانند درمان با آنتی بیوتیک ، سرکوب سیستم ایمنی ، یا زخم‌های باز بعد از جراحت ، ایجاد بیماری می‌کنند. عفونت‌های خارجی از ارگانیزم هایی که بخشی از فلور طبیعی انسان نیستند ناشی می‌شوند ؛ آن‌ها معمولا گونه‌های spore-forming به عنوان مثال از نوع Clostridium هستند که در خاک ، گیاهان و آب یافت می‌شوند. با ایـــن‌حــال بـسـیــاری از عـفــونــت‌هــا عـمــلا نــاشــی از گــونــه‌هــای non-spore-forming بی‌هوازی‌اند ؛ Bacteroides fragilis یک باسیل مرسوم در این گروه است.

اصول عملکرد
محفظه‌های بی هوازی و جعبه‌های دستکش بزرگ ، پلاستیک روشن ، کیسه‌های غیرقابل نفوذ به وسیله هوا یا محفظه هایی هستند که از ترکیبی از گازهای بدون اکسیژن پر شده اند. آن‌ها معمولا قابی از جنس یک فلز محکم (مثلا استیل ضدزنگ) ، اکریلیک یا پـلاستیـک انعطاف پذیر (مانند وینیل) دارند. محفظه‌ها مجهز به آستین و جعبه‌های دستکش مجهز به دستکش هستند که این‌ها به صورت مهر و موم شده به دیواره محفظه یا جعبه متصل هستند و امکان دسترسی پرسنل به داخل را در عین حفظ بی هوازی بودن محیـط داخل فراهم می‌کنند. هر دو سیستم معمولا یک پورت ورودی قفل هوا به صورت یکپارچه یا مدولار ، همراه با یک پمپ خلا و اتصالات مناسب گاز ، یک جعبه کـاتـالیـزور و مـانیتـور اکسیـژن و تجهیـزاتـی بـرای تسهیـل کشـت دادن و ایـزوله کردن بی‌هوازی‌ها (مانند انکوباتورها ، واحد استریل کردن ، محیط کشت) دارند.
محفظه‌های بی هوازی و جعبه‌های دستکش با چند روش ، انتشار اکسیژن به داخل محفظه را حداقل می‌کنند. مدل‌های با دیواره وینیلی در فشار کمی مثبت عمل می‌کنند تا از ورود اکسیژن جلوگیری شود. محفظه‌های محکم تر ، از تنظیم کننده فشار استفاده می‌کنند تا هر بار که دستکش‌ها وارد محفظه می‌شوند ، گاز را بیرون دهند. Bubblerها گـاز محفظـه را بـه صـورت حبـاب از طریق یک ظرف آب به بیرون می‌فرستند. یک انـدازه‌گیـر فشـار دیفـرانسیلـی ، فشـار را بـه صـورت اتـومـاتیـک یـا دستـی بـا استفـاده از دریچه‌های برقی کنترل می‌ کند.
قفل مهروموم دو طرفه در یک انتهای دستگاه دسترسی به محفظه را فراهم می‌کند. یک پمپ خلا ، مخزنی از گازهای ترکیبی و مخزنی از نیتروژن خالص به این پورت متصل است. گاز پمپ شده به داخل دستگاه متشکل از ترکیبی از نیتروژن ، هیدورژن و دی اکسیدکربن است: ۸۰% تا ۸۵% نیتروژن برای یک محیط بی هوازی پایدار ، ۵% تا ۱۰% هیدروژن برای حذف هر مولکول اکسیژنی که احتمالا در محفظه وجود دارد و ۱۰% دی‌اکسیدکربن برای بهبود دادن رشد میکروبی. مخزن دوم شامل نیتروژن ارزان تر با درجه تجاری است که قفل ورودی را پر می کند. (برخی از آزمایشگاه ها ، برای کاهش هزینه‌ها خودشان گازها را ترکیب می‌کنند.)
Antechamber بعد از این که مواد کشت داخل محفظه قرار داده شدند ، تخلیه شده و در قفل می شود. تخلیه را می‌توان به صورت دستی انجام داد یا برای کاهش خطا این کار به صورت اتوماتیک انجام شود. قفل ورود تا فشار ۲۰ اینچ جیوه تخلیه می‌شود و دوباره با نیتروژن پر می‌شود ، سپس دوباره خالی شده و پر می‌شود. بعد از سومین و آخرین پر شدن ، قفل ورودی با ترکیب نیتروژن/هیدروژن/دی اکسید کربن پر می‌شود. سپس اپراتور می‌تواند در داخل قفل (که به سمت داخل محفظه است) را باز کند و مواد را با حداقل آلودگی توسط اکسیژن هوا ، وارد محفظه کند. یک fan ، گازهای داخل محفظه را داخل جعبه‌های کاتالیزور پالادیوم ، گردش می‌دهد که در آنجا هیدروژن هوا برای از بـیـن بـردن مـولـکـول‌هـای اکـسیژن و حفظ شرایط بی هوازی بودن داخل محفظه ، با کاتالیزور واکنش می‌دهد. اگر هیچ نشتی وجود نداشته باشد و اگر کاتالیزور به اندازه مصرف ، مجدداً تولید شود ، محفظه می‌تواند با تنها مقادیر کمی از گازهای دیگر ، در فشار پایینی از اکسیژن نگه داشته شود. مقدار سولفید هیدروژن و رطوبت تولیدشده تعیین می‌کند که کاتالیزورها با چه فرکانسی باید بازتولید شوند. نرخ انتشار اکسیژن به داخل محفظه هم روی فعالیت کاتالیزور تأثیر دارد. هر چه اکسیژن بیشتر باشد ، نیاز است که کاتالیزور با نرخ بیشتری بازتولید شود و حجم بالای اکسیژن مانع از عملکرد بهینه کاتالیزور می شود. نفوذپذیرترین ماده به اکسیژن که استفاده می‌شود neoprene است که در دستکش‌ها یا آستین‌ها به کار می‌رود.  
اغـلب محفظه‌های بی هوازی انکوباتورهایی دارند که رشد ارگانیزم‌های کشت داده‌ شده را افزایش می‌دهند. بسته به اندازه دستگاه ، انکوباتور می‌تواند داخل محفظه اصلی قرار داده شود یا به خارج از آن متصل شود. انتخاب دیگر تنظیم دمای کل محفظه با استفاده از جعبه‌های کاتالیزور گرم شده است. جعبه‌ها fan هایی دارند که هوای مـحفظه را از کاتالیزورهای گرم شده گردش می دهد. برای جلوگیری از رشد مواد آلاینده ، رطوبت داخل محفظه (که در اثر تبخیر آب محیط و واکنش هیدروژن و اکسیژن ایجاد می‌شود) ، با استفاده از جاذب رطوبت ژل سیلیکون ، در سطح ۵۰% یا کمتر نگه داشته می‌شود. برای حفظ موثربودن این خشک کننده ، باید گاهی اوقات آن را به مدت دو ساعت تا ۱۱۰ درجه گرم کرد. مواد دیگر جاذب رطوبت هم می‌توانند استفاده شوند ، به شرطی که با دی اکسید کربن واکنش ندهند.  
مهم‌ترین فرایند کنترل کیفیت مانیتورکردن شرایط بی هوازی داخل محفظه است. تنها وسیله ای که قادر است مقدار اکسیژن را در حضور دی اکسیدکربن اندازه بگیرد ، یک آنالایزر اکسیژن است که به مقادیر بسیار کمی از اکسیژن هم حساس است. برخی از آنالایزرها بوروهیدرید سدیم (Sodium borohydride) دارند که اکسیژن آزاد می‌کند. برخی دیگر پودر آهن دارند که به اکسیژن متصل می شود یا اسید اسکوربیک دارند که اکـسـیـژن را جـذب مـی‌کـنـد. روش‌هـای دیـگـر تـشـخـیـص اکـسـیـژن مـانـنـد رنـگ‌های اکسیداسیون حساسیت کمتری دارند.
متیلن آبی (پتانسیل اکسیداسیون (mv11+ و  reazurin) پتانسیل اکسیداسیون mv 42-) شاخص‌های بی هـوازی مـرسوم هستند. رنگ‌ها بعد از کاهش بدون رنگ هستند ؛ بعد از اکسیژن‌دار شدن ، به ترتیب آبی و صورتی می‌شوند. اما متیلن آبی در غـلـظـــت‌هـــای اکـسـیــژن ppm200 تــا ppm 300 هـمـچـنـان کـاهـش مـی‌یـابـد کـه همیـن مـوضـوع ممکن است مانع از رشد بی‌هوازی‌های بسیار حساس به اکسیژن شود. Reazurin یک شاخص با حساسیت قابل قبول است ؛ اما باید مستقیماً داخل محیط باکتریولوژیک گنجانده شود. این روش‌هــا بـرای آزمـایـشـگـاه‌هـای بـالـیـنـی کـافـی هستنـد ، امـا حسـاسیـت آن‌هـا کمتـر از آنـالایـزر اکسیژن است. روش دیگر برای مانیتور شدت اکـسـیــژن ، اسـتـفــاده از آنــالایــزر گــاز اکـسـیــژن-هـیـدروژن بـرای حـس کـردن حـرارت اکسیژن هیدروژن واکنش با جزء پالادیوم است. روش دیـگـر هـم کـشت مداوم نمونه بذر داده شده با Clostridium novyi نوع B است. رشد این ارگانیزم نشان می‌دهد شدت اکسیژن در محفظه به اندازه کافی پایین است.
زنده ماندن نمونه کشت داده شده را می‌توان مستقیماً داخل محفظه تست کرد. می‌توان برای اسـتـریـل کـردن حلقه‌های انتقال و دریچه‌های لـولـه تـسـت ، یـک بـلـوک گـرم کـردن نـیـز داخـل محفظه در نظر گرفت (شعله‌های گاز را به خاطر نبود اکسیژن ، نمی توان استفاده کرد.) محیط و دیـگــر تجهیـزات مـاننـد طبقـات را نیـز مـی تـوان داخل محفظه قرار داد.

مشکلات گزارش شده
یـــک دلــیــل مــرســوم بــرای نـشــت اکـسـیــژن ، سائیده‌شدن دستکش‌ها است که منجر به ایجاد بـرش کـوچـکـی در دسـتـکش و در ماده دیواره انعطاف‌پذیر اطراف محل‌های ورود دستکش می‌شود. این معمولا در محفظه هایی که چنـد سـال استفـاده شده اند رخ می‌دهد ، زیرا انعطاف پذیری وینیل با گذر زمان کم می‌شود. همچنین ممکن است نشت اکسیژن از اطراف محل‌های ورودی دستکش در دستگاه‌های با ساختار بسیار محکم رخ دهد.
در مورد هر دو مدل با ساختار مستحکم و با ساختار انعطاف پذیر ، ممکن است در حین کار با مواد تیز داخل محفظه و به ویژه طبقه ها ، برش در دستکش ایجاد شود. هر نشتی منجر به مصرف سریع تر ترکیب گاز استفاده شده در فضای بی هوازی می‌شود. یک پروب ارزان و موثر الکترونیکی برای نشت گاز که با تشخیص گازهای قابل احتراق (مانند هیدروژن) عمل می‌کند ، موجود است.
کار با مدل هایی که محفظه آن‌ها گرم می شود برای طولانی مدت می‌تواند موجب ناراحتی اپراتور شود. به علاوه گرم کردن سریع محفظه ، محیط داخل آن را خشک کرده و کنترل رطوبت در محفظه را مشکل تر می‌کند.  
یـک محقـق زمـانـی کـه یک محفظه بی هوازی در حال انتقال از شرایط هوازی به بی‌هوازی بود ، انفجارهایی را در آزمایشگاه تجربه کرد (۱۹۹۷ Cox). در طول انتقال از شرایط بی هوازی به هوازی یابالعکس ، ترکیبی از اکسیژن از هوا و هیدروژن در ترکیب گاز می‌تواند به غلظت قابل اشتعال برسد.
نقص در بازتولید کاتالیزور پالادیوم و مینیمم کردن شدت اکسیژن باقی مانده در جعبه دستکش می تواند باعث آسیب به بی هوازی‌ها شود. بی هوازی ماندن همیشه مسـألـه اصلی است ؛ بنابراین خریداران همیشه باید از میزان موثر بودن آنالایزرهای اکـسـیــژنــی کــه هـمــراه مـحـفظـه بـی هـوازی اسـت ، آگـاه بـاشنـد. طبـق تحقیقـات اخیـر سیستم‌هایی که از اسیداسکوربیک یا یک روش تخلیه-جایگزینی استفاده می‌کنند ، در تـأمـیـن اتـمـسـفر بی هوازی موثرترین بوده اند در حالی که سیستم‌های borohydride کمترین کارائی را از خود نشان داده اند ۱۹۹۶ Imhof and Heinzer.

توصیه‌های خرید
توصیه‌های ECRI
عملکرد اصلی این دستگاه ها تأمین یک محیط عاری از اکسیژن و پایدار برای رشد و مطالعه ی میکروارگانیزم‌های بی هوازی است. بنـابـرایـن ECRI تـوصیـه می‌کند که محفظه‌های بـــی هــوازی و جـعـبــه‌هــای دسـتـکــش مــانـیـتــور اکسیژن و نیز وسیله ای برای به گردش درآوردن گـازهـای اکسیـژن داخـل محفظـه داشتـه باشند. سیستم مانیتور اکسیژن می‌تواند بسته به کارائی کـاربر متفاوت باشد. همچنین توصیه می شود که یک پمپ تخلیه به صورت یکپارچه درنظر گرفته شده باشد ؛ گرچه این ویژگی بهتر است مـوجـود بـاشـد امـا الـزامـی نیسـت. خـلاءسنج و تنظیم کننده‌های فشار برای یک سیستم ایمن و قابل اطمینان ضروری هستند. حذف رطوبت نیز برای پیشگیری از رشدآلاینده‌ها نیاز است.

توصیه‌های دیگر  
بیمارستان هایی که نیاز به کشت و شناسایی سریع حجم بالایی از عوامل میکروبی دارند باید بـــه فـکـــر خـــریــد مـحـفـظــه‌هــای بــی هــوازی یــا جــعــبــــه‌هــــای دســتــکــــش بـــاشـنـــد. مـحـفـظـــه و antechamber بـایـد بـرای تـأمـیـن فـضـای کـاری موردنیاز ، به اندازه کافی بزرگ باشند. برخی از تـولیدکنندگان محفظه‌های کاری اضافی و نیز سـیـنـی‌هـا و قفسـه‌هـای اضـافـی ارائـه مـی‌کننـد. Antechamberهــای اتــومــاتـیــک مـعـمـولا زمـان ورود به محفظه را کاهش می دهند ؛ آن‌ها اغلب همراه با Antechamberهای دستی برای تسهیل تخلیه اولیه محفظه استفاده می‌شوند. مدل هایی که مجهز به انکوباتور یا بلوک‌های گرم کننده داخـلــی هـسـتـنــد ، نـیــاز بــه انـتـقــال نـمــونـه‌هـا بـه محیط‌های بی هوازی خارجی را از بین می‌برند و لـذا بـه ایـن وسـیله احتمال آلودگی را کاهش می‌دهند.

مراحل توسعه
مـحـفـظـه‌هـای بـی هـوازی تـکـنـولوژی بسیار پایداری دارند. توسعه هایی در اتوماتیک کردن فرایند تخلیه-جایگزینی و در محفظه‌های تنظیم اتمسفر داخلی ایجاد شده اند.