طیف سنج نوری یا اسپکتروفتومتر Spectrophotometer یکی از دستگاههای آزمایشگاهی بسیار مهم است که به وسیله آن نتایج آزمایشهای end point مشخص می شود و پس از آن متخصص آزمایشگاه با استفاده از آن به تفسیر آزمایش می پردازند.
نحوه عملکرد دستگاه:
اسپکتروفتومتر میزان جذب یا عبور طول موج‌های مشخصی از انرژی تابشی (نور) از یک محلول را اندازه گیری می‌کند بیشترین کاربرد آن در آزمایشگاه، در بخش بیوشیمی است.اساس کار اسپکتروفتومتر همانند بسیاری از دستگاههای آزمایشگاهی، بر اندازه گیری میزان نور جذب شده توسط یک محلول رنگی است که طبق قانون بیر-لامبرت میزان جذب نور (OD) متناسب با غلظت ماده حل شده در محلول است.
اسپکتروفتومتر (Spectrophotometer)
کووت
کــووت‌هــا مـحـفـظــه‌هــای شـفــافــی هـستنـد کـه مـحـلـول مـورد آزمـایـش در آن ریـخـتـه شـده و در جایگاه خاص خود که در مسیر نور تکرنگ تعبیه شده است قرار می‌گیرد. کووت‌ها با توجه به نوع مصرف، جنس، شکل و حجم متفاوتی دارند. برای مـحـلــول‌هــای اسـیــدی و قـلـیــایـی از کـووت‌هـای مـخـصوص شیشه‌ای و برای طول موج‌های زیر ۳۲۰ نـانـومـتـر از لـولـه کوارتز یا پلاستیک استفاده می‌شود.
کالیبراسیون
کالیبراسیون اسپکتروفتومتر، فرایندی است که در آن مراحلی جهت تضمین صحت کار دستگاه به‌کار گرفته می‌شود. این روش تضمین می‌کند که اندازه گیری‌های به دست آمده توسط وسیله مورد نـظــر دقـیــق هـسـتـنــد. روش کــالـیـبــراسـیــون بــرای مدل‌های مختلف متفاوت است با این حال اکثر تـولـیـدکـنـنـدگـان کـتـابـچـه راهـنـمـایـی را کـه شـامل جزئیات کالیبراسیون و نحوه کار با دستگاه است، برای استفاده کاربران فراهم می کنند.
اسپکتروفتومتر قادر است تا به عنوان فرستنده و گـیــرنــده نــور عـمـل کنـد. ایـن وسیلـه بـرای آنـالیـز نمونه‌هایی از ماده تست، توسط عبور نور از درون نمونه و خواندن شدت طول موج‌ها مورد استفاده قــرار مــی‌گـیــرد. نـمــونــه‌هــای مـخـتـلـف نـور را بـه روش‌هـای مختلـف فشـرده مـی‌کننـد و بـه محقق اجازه می‌دهند تا توسط بررسی رفتار نور هنگام عبور از نمونه مورد نظر، با ساختار آن بیشتر آشنا شوند. در کالیبراسیون این وسیله، از یک محلول مرجع جهت تنظیم صفر دستگاه استفاده می‌شود. در اسپکتروفتومتر تک پرتویی، یک پرتو نور تولید و دستگاه باید بعد از هر بار استفاده، کالیبره شود. در نــوع دو پــرتـویـی، پـرتـوهـا از طـریـق نمـونـه تسـت فرستاده می‌شوند و نمونه مرجع در همان زمان، دو مجموعه از نتایج را که می‌تواند به عنوان مرجع و کـــالــیـبــراسـیــون اسـتـفــاده شــود، تــولـیــد مــی‌کـنــد. کـالـیبراسیون می‌تواند در آزمایشگاه توسط افراد باتجربه نیز صورت گیرد. البته اگر دستگاه دچار آسیب یا مشکل جدی شود، باید جهت تعمیر و تنظیمات اولیه به کارخانه سازنده یا نمایندگی‌های معتبر ارجاع داده شود.
۱- دستگاه را روشن کنید و ۱۰ دقیقه منتظر بمانید تا دستگاه گرم و آماده به کار شود.
۲- نور محفظه را تغییر دهید تا به طول موج مورد نظر برسید.
۳- کووت را تا نیمه با محلول واکنش پر کنید. کووت نباید حاوی نمونه ناشناخته باشد.
۴- دو طرف کووت را با دستمال پاک کنید.
۵- آن را در مـحـفـظــه قــرار دهـیـد و درب آن را ببندید.
۶- منتظر بمانید تا اندازه گیری تمام شود.
ارزیـابـی صـحـت طـول مـوج به منظور ارزیابی ادعـای سـیـسـتـم درتـابـاندن طول موجی است که دستگاه برای آن تنظیم شده است.
راحت‌ترین و قابل دسترس‌ترین روش برای اسپکتروفتومترهایی که با نور مرئی کار می‌کنند، اســتــفـــاده از مـحـلــول سـیــان مــت هـمــوگـلــوبـیــن (۲۰ میکرولیتر خون و ۵ میلی لیتر درابکین ) بوده که دارای حــــداکــثــــر جــــذب نـــوری در طـــول مـــوج ۵۴۰ نانومتر است. ابتدا با محلول درابکین به عنوان بلانک دستگاه را صفر کرده و سپس جذب نوری نمونه در طول موج ۵۳۰ ، ۵۳۵، ۵۴۰ ، ۵۴۵ و ۵۵۰ نـانـومـتـر قـرائـت مـی‌شـود. بر‌‌اساس طول موج و مـیـزان جـذب ،یـک مـنـحـنـی رسـم می‌شود که در صورت وجود صحت طول موج ، حداکثر جذب نوری را در ۵۴۰ نانومتر نشان خواهد داد.
آزمون رانش فوتومتری
یکی از منابع اصلی خطا در اسپکتروفتومتری، کــه بــه عـلـت فـرسـودگـی شـدیـد مـنـبـع نـوری رخ می‌دهد، عدم پایداری مقدار جذب خوانده شده درطول زمان است. برای بررسی، ابتدا دستگاه را با درابـکـیــن صـفــر کــرده و پــس از ریـخـتـن محلـول سیان‌مت هموگلوبین در کووت و بستن درب آن با پارافیلم، جذب نوری این محلول هر ۵ تا ۱۵ دقیقه یک‌بار (به مدت یک ساعت) قرائت کنید. حداکثر تغییر مجاز در جذب‌های نوری قرائت شده طی این مدت ۰۰۵/۰-+ است. به عنوان مثال اگرجذب محلولی در ابتدا ۲۵۹/۱ باشد، در مدت یک ساعت می‌تواند در محدوده ۰۰۵/۰ -+ ۲۵۹/۱ تغییر کند.
نحوه کار با اسپکتروفتومتر D 20/20
۱- دستگاه را روشن کنید. اجازه دهید تا به مدت ۱۵ دقیقه گرم شود.
۲- طول موج مورد نظر را با دکمه قرار گرفته در کنار محفظه نمونه تنظیم کنید.
۳- محفظه نمونه را بررسی کنید تا از خالی بودن آن مطمئن شوید. دکمه مربوط به تنظیم صفر را که در جـلـو و سـمـت چـپ اسـپـکـتـروفـتـومـتـر اسـت، بچرخانید تا مقدار صفر را نمایش دهد.
۴- برای اطمینان از پاکیزگی و کاهش اشتباه در نتایج اندازه گیری، از دستکش استفاده کنید.
۵- ۴/۳ کووت را با آب مقطر پر کنید و آن را در نگـه دارنـده قـرار دهید. کووت را به سمت پایین فشار دهید تا در جای خود تراز شود. دقت کنید که خارج کووت تمیز و خشک باشد.
۶- دکمه کنترل نور را که در جلو و سمت راست دستگـاه قـرار دارد، بچـرخانید تا مقدار عبوری یا جذب را بخواند.
۷- سپس کووت نمونه را در محفظه قرار دهید. مقدار نشان داده شده را ثبت کنید.
کالیبراسیون اسپکتروفتومتر مادون قرمز
اسپکتـروفتومتر مادون قرمز از پلی استایرن به عنوان یک استاندارد کالیبراسیون استفاده می کند. A-Scan ابــزار بــا یــک قـطـعــه از پـلــی استـایـرن در نگه‌دارنده نمونه، حضور قله‌های دیده شده روی طیف IR و شدت نسبی قله‌ها را بازبینی می‌کند.
۱- اسپکتروفتومتر را روشن کرده و جهت ثبات دستگاه، اجازه دهید تا ۱۰ دقیقه گرم شود. بدون وجود منبع پایدار، نمی توان بر طیف به دست آمده اعتماد کرد.
۲- اسـتـانـدارد کـالـیـبـراسیون را توسط قراردادن نمونه‌ای از فیلم پلی استایرن در نگه دارنده نمونه انجام دهید. بدون اجرای آزمون با استفاده از یک نـمـونه از طیفی شناخته شده که استاندارد نامیده می‌شود، نمی‌توانید در مورد درستی و صحت کار دستگاه به یقین برسید.
۳- طیف را برای نمونه پلی استایرن بازیابی کنید. طیف را با یکی از مراجع استاندارد طیف IR مقایسه کنید تا مطمئن شوید که همه قله‌های مورد انتظار روی طیف آزمون وجود دارد.
۴- طـیـف را بـررسـی کـنـیـد تـا مطمئن شوید که قدرت سیگنال درون ۹۵% از حداکثر قوی‌ترین قله است.
۵- میرایی را تنظیم کنید تا به سیگنال صحیح و مورد نظرتان دست یابید.
توجه
مـمـکن است فیلترهای نوری خاصی برای تـعـدادی از دسـتـگاه‌ها نیاز باشد که با طول موج ویژه‌ای کار می‌کنند.
اگر طول موج تغییر کرده است یا بعد از هر نمونه‌گیری، باید صفر دستگاه تنظیم شود.
اطمینان حاصل کنید که کووت‌ها خالی از هرگونه ذرات، لکه یا اثر انگشت است. این مورد می‌تواند محاسبات دستگاه را تحت تاثیر قرار دهد.
اسـپـکـتــروفـتــومـتـرهـا گـران هستنـد. مـراقـب باشید تا به آن‌ها صدمه‌ای وارد نشود.
بررسی های روزانه
اتـصـالات الـکـتریکی را به طور کامل بازرسی کنید تا هیچ گونه ساییدگی نداشته باشند.
تحت هیچ شرایطی کارکنان مجاز به بازکردن دستگاه نیستند.
هرگونه مایعات خارجی و مواد شیمیایی ریخته شده را از روی دستگاه و قسمت‌های مجاور آن، پاک کنید.
نگه دارنده نمونه را مخصوصا بعد از به کاربردن محلول‌های نمکی یا خورنده به دقت تمیز کنید.
کــــووت‌هــــا را بـــلافـــاصــلـــه بــعـــد از اســتــفـــاده بـشــوییـد.سپـس آن‌هـا را بـرعکـس کنیـد تـا کـامـلا خـشــک شــونـد. اجـازه نـدهـیـد نـمـونـه در کـووت خشک شود.
انواع اسپکتروفتومتر
اسپکتروفتومتر تک پرتو و دو پرتو
اسپکتروفوتومترها به دو دسته تقسیم می شوند: تک پرتو و دو پرتو. اسپکتروفوتومترهای تک پرتو اولین نسل اسپکتروفوتومترها بوده و تمام نور از بین نمونه عبور می کنند. در این نوع برای اندازه‌گیری شدت نور تابشی باید به این نکته توجه داشت. این اسپکتروفوتومترها ارزان تر هستند چرا که بخش های کمتری داشته و سیستم آن‌ها پیچیدگی کمتری دارند. نسل جدیدتر اسپکتروفوتومترها نوع دو پرتو است. در این نوع نور قبل از اینکه به نمونه برسد به دو پرتو مجزا تفکیک می شود که این مسئله یک امتیاز تلقی می‌شود زیرا خواندن منبع و نمونه به صورت همزمان انجام می‌شود. در برخی از اسپکتروفوتومترهای دو پرتوی، دو آشکارساز وجود دارد بدین ترتیب امکان اندازه‌گیری همزمان پرتوهای نمونه و مرجع فراهم می شود. سایر اسپکتروفوتومترهای دو پرتوی که تنها یک آشکارساز دارند از برشگر پرتو استفاده می کنندکه این وسیله در هر لحظه یک پرتو را سد کرده و آشکارساز اندازه‌گیری پرتو نمونه و مرجع را به صورت یک در میان انجام می دهد.
اسپکتروفتومتر نور مرئی
در آزمایشگاه‌ها، بخش گسترده ای از اندازه گیری‌ها بر اساس واکنش‌های جذب سنجی صورت می‌پذیرد. فعالیت اکثر آنزیم‌ها، تری گلیسیرید، کلسترول، لیپو پروتئین‌ها، قند، کراتینین، اوره و . . . طیف وسیعی از آنالیت‌ها با کاربردهای بالینی و تحقیقاتی، طیف وسیعی از داروها و بخش گسترده‌ای از متابولیت‌ها با اسپکتروفتومتری قابل سنجش است. بررسی ساختمان مولکولی، شناسائی ترکیبات، مقایسه ساختمان‌ها، یافتن طول موج ماکزیمم جذب و . . . از دیگر کاربردهای اسپکتروفتومتری در مسائل تحقیقاتی است.محدوده نور مرئی حدود ۷۰۰-۴۰۰ نانومتر است. اسپکتروفوتومترهای ناحیه مرئی دقت و صحت متغیری دارند. برخی از آن‌ها آشکارسازCCD با پیکسل‌های کافی برای قرائت هرnm10 را دارند، درحالیکه برخی دیگر می‌توانند در هر نانومتر چندین قرائت انجام دهند. این اسپکتروفوتومترها می‌توانند از منابع نور سیمابی، هالوژن،LED یا ترکیبی از این منابع مثل LED تقویت شده با رشته‌های تنگستن استفاده کنند.
اسپکتروفتومتر نور ماوراء بنفش
اسپکتروفوتومترUV علاوه بر اینکه در طیف سنجی مایعات بسیار متداول است، برای گازها و همچنین جامدات نیز استفاده می شود. نمونه را در محفظه مستطیلی مخصوص که معمولا یک سانتی متر پهنا دارد قرار می دهند. این محفظه که کاوت(cuvvette) نامیده می شود می‌تواند شکل پلاستیک، شیشه یا کوارتز داشته باشد. پلاستیک و شیشه، UV را جذب می کنند از اینرو تنها می‌توان آن‌ها را برای اسپکتروفوتومتری نور مرئی استفاده کرد.
اسپکتروفتومتر نور مادون قرمز
اسپکتروفوتومتر مادون قرمز در شناسایی مولکولی و ارتعاشات وابسته به ساختار آن استفاده می شود. ساختارهای شیمیایی متفاوت، به دلیل تفاوت در انرژی های مربوط به هر طول موج، راه‌های مختلفی در پاسخ به طول موج های مختلف دارند. به عنوان مثال مادون قرمز‌های برد متوسط، تمایل به لرزش دورانی دارد، درحالیکه مادون قرمز نزدیک (با انرژی بالاتر) تمایل به لرزش هارمونیک مولکولی مانند جنبش دارد.
در اسپکتروفوتومترهایIR متداول یک پرتو مادون قرمز مستقیما به نمونه می تابد و تمام طول موج‌های طیف نسبت به پرتو مرجع اندازه‌گیری می‌شود. به منظور تولید طیفی با کیفیت بالا، باید پهنای طیف ورودی به آرامی اسکن شود. اسپکتروسکوپیIR با روش بسط تبدیل فوریه اصلاح می شود. قلب اسپکتروفوتومترهای IR تداخل سنج میشلسون است.ور تابش شده از منبعIR به سمت سلول‌های نمونه هدایت می شود. نیمی از پرتو تابشی از آینه ثابت باز تابیده شده و نیم دیگر آن از آینه ای که مرتبا در فاصله ای حدود دو و نیم میکرومتر حرکت می کند منعکس می‌شود. هنگامی که دوباره دو پرتو در آشکارساز با هم ترکیب می شوند و تداخل به وجود می آید، حدود دو ثانیه یک اسکن از فاصله ورودی گرفته شده و در کامپیوتر ذخیره می شود. به همین ترتیب چندین اسکن دیگر نیز به طور همزمان به آن اضافه می شود. با توجه به نوسانات و ارتعاشات حرارتی در آزمایشگاه بدیهی است که این امر نا ممکن است. پس به منظور حل این مشکل از لیزر هلیم – نئون برای تاباندن به تداخل سنج میشلسون استفاده می شود و تداخل لیزر به عنوان فرکانس مرجع به کار گرفته می شود. کارائیFTIR از دستگاههای معمولی بیشتر است که می‌توان تنها با مقدار کمی از نمونه و در زمانی کوتاه به طیفی عالی دست یافت.
اسپکتروفتومتر نشر شعله Flame
ساختمان این دستگاه شبیه اسپکتروفتومتر یا فتومتر ساده است با این تفاوت که در فتومتر، لامپ الکتریکی و در این دستگاه نور حاصل از سوختن ماده مورد آزمایش در درون شعله به عنوان منبع نوری در نظر گرفته می‌شود. در طیف سنجی نشر شعله، نور حاصل مستقیما اندازه‌گیری می‌شود.
اسپکتروفتومتر جذب اتمی Atomic Absorption
اسپکتروفتومترهای جذب اتمی (AAS) غلظت عناصر فلزی که از نظر پزشکی برای حفظ سلامتی مهم است را اندازه گیری می‌کند. در خصوص این عناصر می‌توان به کلسیم، منیزیم، مس، روی و آهن اشاره نمود. اسپکتروفتومترهای جذب اتمی همچنین برای تعیین اینکه آیا سطح درمانی داروهایی نظیر لیتیم در خون، تامین شده است یا خیر و همچنین برای آشکارسازی و تعیین کمیت سموم فلزی مورد استفاده قرار می‌گیرد.
استفاده از اسپکتروفوتومتر
اسپکتروفوتومترها مستقیما برای اندازه‌گیری شدت نور در طول موج های مختلف استفاده می شود و می‌تواند نماینده درصد نور تابشی مخابره شده یا جذب شده باشد. با استفاده از این اطلاعات و مقایسه آن با دانسیته‌ها و داده‌های به دست آمده می‌توان اسپکتروسکوپی را به عنوان یک ابزار استفاده کرد. مقایسه طیف‌ها برای تعیین غلظت جسم حل شده موجود در حلال مثال خوبی است. بدین ترتیب که با ثبت نور ارسال و دریافت شده در طول موجی خاص و بررسی طول موج جذب شده توسط حلال می‌توان به غلظت آن پی برد. سپس آنالیز محلول با غلظت ناشناخته، با داده های معلوم مقایسه شده و به کمک تناسب غلظت محاسبه می‌شود. این عمل برای محلول‌هایی که در آن‌ها چندین نوع حلال وجود دارد نیز قابل استفاده است والبته به دقت بیشتری در آنالیز طول موج ها احتیاج دارد. با توجه به حساسیت اسپکتروفوتومترFTIR مناسب ترین و رضایت بخش ترین روش آماده سازی نمونه، تبخیر ساده محلول نمونه در صفحه ای از نمک KBr و دست یافتن به طیفهای فیلم نازک باقی مانده است. این روش طیفی بسیار خوب با خط مبداء مسطح به وجود میآورد.
اسپکتروفوتومترهایی که منبع نور ندارند اما طیفهای مبنی بر نور وارده را تولید می کنند می‌توانند با روشی مشابه برای تعیین منبع نور استفاده شوند. می‌توان منحنی طیفهای به دست آمده از منبع نوری نامعلوم (یا ترکیبی از منابع) را با اطلاعات منحنی های منبع نور مشخصی مقایسه کرد و منبع نور ناشناخته را شناسایی کرد.
از دیگر کاربردهای اسپکتروفوتومتر می‌توان به تعیین ثابت موازنه واکنش های یونی که در محلول‌های آبی انجام می شود اشاره کرد. در ابتدا طیفهای محلولی که تنها شامل یک واکنش دهنده است اندازه‌گیری می شود. سپس دیگر واکنش دهنده‌ها به آن اضافه می شود و پس از هر بار افزایش، طیف سنجی صورت می گیرد. این روش در صورتی به صورت مطلوب کار می کند که طول موج جذب شده توسط محصول مقداری مشخص باشد. از آنجا‌که بیشتر محصولات از اضافه کردن چندین واکنشگر به دست میآیند، زمانی که محلول اشباع شده و واکنش موازنه می شود نورهای بیشتری جذب شده و افزایش نور جذب شده برابر ثابت موازنه است.
در هنگام نصب دستگاه اسپکتروفوتومتر باید به نکات زیر توجه داشت:
۱- اسپکتروفوتومتر باید روی سطحی سفت و در محیطی خشک و تمیز نصب شود.
۲- به جهت امکان جریان هوا در اطراف اسپکتروفوتومتر ، باید بین دستگاه و دیوارهای اطراف ۵۰ میلیمتر فاصله باشد.
۳- کابل برق دستگاه به پریز گراند شده با ولتاژ مناسب وصل شود.
۴- پس از اتصال آداپتورAC به برق، خروجی آن باید به گونه ای به دستگاه وصل شود که منبع ذخیرهDC در مسیر آن قرار گیرد.
۵- در صورتی که خود دستگاه فاقد پرینتر است، باید از طریق پورت مخصوص آن‌را به پرینتر وصل کرد.
۶- پس از روشن کردن دستگاه مدتی صبر کرده تا دستگاه گرم شده و به پایداری حرارتی و الکترونیکی برسد.
